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生化培養(yǎng)箱使用于次級代謝產(chǎn)物生物活性研究

返回列表 來源:未知 發(fā)布日期:2019-08-20 09:44【
0 引言

阿爾茨海默?。ǎ粒欤瑁澹椋恚澹?rsquo;sdisease,AD)又稱遺忘型癡呆癥,是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,嚴重影響患 者的認知、記憶以及社會生活能力 .AD的發(fā)病機制一直是研究者密切關注的問題,其中主要涉及膽堿能 功能障礙、Aβ淀粉樣蛋 白、氧化應激及自由基損傷等 .目 前 臨 床 治 療 AD 主 要 采 用 以 乙 酰 膽 堿 酯 酶 (AChE)為藥物靶點的乙酰膽堿酯酶抑制劑(AChEls);另有研究指出,氧化應激可能會增加自由基的水平, 從而導致 Aβ淀粉樣蛋白升高,因此清除細胞內(nèi)過剩的自由基或成為治療 AD的新方向.



1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 牡蠣及菌株來源


在日照海域采集野生牡蠣,通過分離純化得到共生細菌.



1.1.2 培養(yǎng)基

(g/100mL).LB液體培養(yǎng)基:胰蛋白胨1g,酵母浸粉0.5g,過濾滅菌海水100mL,PH 自 然;LB固體培養(yǎng)基:LB液體培養(yǎng)基 +1.6 % 瓊脂粉.



1.1.3 主要儀器和試劑

恒溫振蕩培養(yǎng)箱(上海一恒科學儀器有限公司),恒溫生化培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設備有限公司),PCR儀(美國BIO-RAD),多功能檢測儀(美國Biotek公司),旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮儀器有限 公司);細菌基因組 DNA 提取試劑盒、PCR擴增等試劑均購自天根生化科技有限公司,碘代硫代乙酰膽堿(ATCI)、乙酰膽堿酯酶(AChE)及 DTNB,1,1- 二苯基 -2- 三硝基苯肼(1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH) 等試劑均購自上海源葉生物科技有限公司.



1.2 方法

1.2.1 牡蠣內(nèi)生細菌分離與純化


將新鮮野生牡蠣于75% 酒精中浸泡30-60s,無菌海水潤洗3次,稱?。保?g牡蠣肉于100mL滅菌海水中浸泡,160r獉min-1 振蕩45min,勻漿,過濾得牡蠣菌懸液.無菌條件下從菌懸 液中吸取10μL至三角瓶中,滅菌海水補足至500mL,得到10-1 的菌液,然后梯度稀釋分別得到10-2、10-3、 10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9 菌液.吸?。保埃?mu;L上述各濃度菌液均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上,置于37℃ 恒溫培養(yǎng)箱中,定期觀察,分離純化得到單一菌落.



1.2.2 牡蠣內(nèi)生細菌的鑒定

參照文獻提取已分離純化菌株的DNA,以27F/1492R為引物進行PCR擴 增,PCR反應條件為:預變性95℃3min→ 變性95℃45s→ 退火55℃45s→ 延伸72℃50s→ 充分延伸 72℃10min→ 保存16℃2min→ 循環(huán)擴增35次,取5μLPCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,其余送蘇州金 唯智生物科技有限公司測序.



1.2.3 牡蠣內(nèi)生細菌次級代謝產(chǎn)物發(fā)酵液提取

將分離出的菌株接種至 LB液體培養(yǎng)基中,恒溫振蕩培養(yǎng) (36h,37 ℃,160r獉min-1).離心發(fā)酵液(6500r獉min-1,25min)取上清,2倍體積乙酸乙酯萃取3次,合并 乙酸乙酯層,濃縮得粗浸膏,將上述粗浸膏溶于 DMSO,配置成5mg·mL-1 溶液備用.



1.2.4 AChE活性測定

參照文獻采用改良 Ellman法測定其對 AChE 的抑制活性.磷酸緩沖溶液(0.1 mol獉L-1,PH=8.0),AChE(0.05U獉mL-1),DTNB(0.0667mol獉L-1),ATCI(0.1mmol獉L-1).?。粗В?mLEP管,設置空白(A1)、標準(A2),樣品本底(A3),樣品(A4)組.分別加入磷酸緩沖溶液2950μL、2880 μL、2950μL和2880μL;A1 和A2 組中分別加入DMSO100μL;A3 和A4 組中加入100μL的待測樣品溶液; A2 和A4 組加入70μL的AChE溶液.充分混勻,冷藏20min后,分別加入100μL的DNTB和20μL的ATCI 溶液,得到最終的反應體系.37 ℃ 水浴反應25min后,加終止劑0.4% SDS(100μL).本實驗以鹽酸他克林 (Cognex)作為陽性對照.在412nm 處測得 OD值,按公式計算出抑制率 抑制率(%)= (A2 -A1)- (A4 -A3) A2 -A1 ×100%.



1.2.5 抗氧化活性測定

參照文獻方法,采用DPPH自由基清除法測定牡蠣內(nèi)生細菌次級代謝產(chǎn)物的 抗 氧化活性.以75% 乙醇作為參比溶液調(diào)零,空白組(A0)中加入75% 乙醇100μL,DPPH 溶液(0.4mmol ·L-1)100μL;樣品組(Ai)中加入待測樣品2μL,75% 乙醇98μL,DPPH 溶液100μL;樣品本底組(A1)中 加入待測樣品2μL,75% 乙醇198μL,以抗壞血酸(Vc)為陽性對照.室溫暗置30min后,在最大波長為517 nm 測 OD值,按照公式計算清除率 清除率(%)= A0 - (Ai -A1) A0 ×100%.



1.2.6 菌株特性觀察

菌株部分生理生化等特性參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》 進行.



2 結果分析

2.1 牡蠣共生細菌的分子生物學鑒定


通過對牡蠣共生細菌進行分離純化、培養(yǎng),共得到并鑒定出牡蠣共生細菌62株.采用通用引物27F和 1492R進 行 PCR 擴 增,經(jīng) 瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳,基 因 測 序 結 果 經(jīng) Blastn 比 對,結 果 表 明,HYML-1-6、 HYML-1-25、HYML-1-34 和 HYML-1-44 菌 株 為 孤 菌 屬;HYML-1-11、HYML-1-22、HYML-1-27、 HYML-1-37、HYML-1-38 和 HYML-1-40 菌 株 為 芽 孢 桿 菌 屬;HYML-1-4、HYML-1-12、HYML-1-19、 HYML-1-31菌株為運動魯杰 氏 菌;HYML-1-15、HYML-1-16、HYML-1-46 菌 株 為 黃 桿 菌;HYML-1-14、 HYML-1-20、HYML-1-52菌株為交替單胞菌;HYML-1-47菌株為嗜熱脂肪芽孢桿菌;其余41株菌株為交 替假單胞菌屬,因此,假單胞菌屬為牡蠣共生細菌中優(yōu)勢菌屬.部分菌株16SrRNA 基因序列比對分析結果 如表1所示.



2.2 牡蠣內(nèi)生細菌次級代謝產(chǎn)物抑制

AChE活性篩選 對牡蠣內(nèi)生細菌的次級代謝產(chǎn)物進行抑制 AChE活性篩選,結果如圖1所示,有13株細菌的次級代謝產(chǎn)物 粗提物(5μg·mL-1)對 AChE具有一定的抑制活性,分別為 HYML-1-3,HYML-1-6,HYML-1-9,HYML-1-10, HYML-1-11,HYML-1-12,HYML-1-18,HYML-1-24,HYML-1-26,HYML-1-27,HYML-1-39,HYML-1-47, HYML-1-62.其中,HYML-1-11和 HYML-1-62菌株次級代謝產(chǎn)物的活性較強,抑制AChE活性IC50 分別為5.01和4.53μg·mL-1. 



3 結論與討論

海洋資源因其特殊的環(huán)境,在長期的進化過程中產(chǎn)生一系列獨特的次級代謝產(chǎn)物,這些次級代謝產(chǎn)物具有化學結構新穎和生物活性多樣的特點,因此海洋資源是產(chǎn)生新型生物活性物質(zhì)的寶庫 .研究表明,從 海綿、藻類和海鞘等分離出的海洋細菌S.tropica、S.arenicola、S.pacifica 等,其次級代謝具有抗癌、 抗菌、抗炎、抗瘧等作用,其中一些已應用于臨床,如環(huán)孢菌素A、利福霉素、環(huán)馬林素D等 .此外,海洋微 生物中芽孢桿菌屬的成員其次生代謝產(chǎn)物表現(xiàn)出多種獨特的結構和生物活性 .王鳳舞等從青島海域牡 蠣中分離得到8株內(nèi)生細菌,然而僅一株細菌的次級代謝產(chǎn)物具有乙酰膽堿脂酶抑制活性,本研究從日照海 域野生牡蠣中分離純化得到62株內(nèi)生細菌,對其進行分子生物學鑒定,結果顯示,其中4株為孤菌屬,6株為 芽孢桿菌屬,4株為魯杰式菌屬,3株為黃桿菌屬,3株為交替單胞菌屬,1株為嗜熱脂肪芽孢桿菌,其余41株 為交替假單胞菌屬,因此,交替假單胞菌屬為牡蠣內(nèi)生細菌中優(yōu)勢菌屬.抑制 AChE 活性和抗氧化活性研究 結果表明,13株菌株具有一定的抑制 AChE活性;22株菌株顯示較強的DPPH 自由基的清除作用.此外還發(fā) 現(xiàn),具有 AChE抑制作用的13株菌株的次級代謝產(chǎn)物均顯示較強的抗氧化活性,揭示其次級代謝產(chǎn)物中含 有潛在的活性物質(zhì),有望為治療以膽堿能缺乏及自由基過剩為特征疾病的先導化合物的開發(fā)提供一定的理 論依據(jù)。







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